2021年10月15日，客服中心反饋某集團客戶有藥物篩選的研發測試需求，通過研究30種中藥提取物對神經細胞TRVP1通道的抑制影響，從而驗證植物提取物是否具有止癢、止痛效果。生物實驗室工程師第一時間與客戶進行詳細溝通，情況如下：

客戶背景

某集團公司從一個資產不足300萬元的生產企業成長為一個總資產76.3億多，總銷售收入逾100億元（2010年末），經營涉及化學原料藥、化學藥制劑、中成藥、中藥材、生物制品、保健食品、化妝品及飲料的研制、生產及銷售；醫療器械（二類、醫用敷料類、一次性使用醫療衛生用品），日化用品等領域的云南省實力最強、品牌最優的大型醫藥企業集團。

樣品名稱

中藥提取物

客戶需求

客戶研究目的是對原料中藥進行藥物靶點篩選，通過細胞毒性測試、膜片鉗、鈣成像等技術手段，從多種提取物種篩選出能搞有效抑制TRVP1靶點的樣品，進行后續下游的工藝研發生產。

解決方案

簽訂合同后，生物醫藥實驗室先進行查閱大量文獻，進行總體方案設計。TRPV1通道蛋白在廣泛表達于Aδ-纖維及C-型纖維等皮膚感覺神經纖維上，激活感覺神經元上TRPV1受體，可產生疼痛、灼熱及瘙癢感，并引起P物質(Substance P，SP)和降鈣素基因相關肽(Calcitonin Gene Related Peptide，CGRP)等促炎介質的釋放，介導神經源性的炎癥，最終導致多種皮膚病和瘙癢癥的發生。該發現獲得了 2021年諾貝爾生理學或醫學獎獲獎。本次實驗就針對TRPV1靶點，?進行3個主要藥效學實驗，詳情如下。

細胞毒性測試：

CCK-8試劑在電子載體1-甲氧基 -5-甲基吩嗪 硫酸二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被細胞線粒體中的脫氫酶還原為具有高度水溶性的黃色甲臜產物（Formazan），生成的甲臜物的數量與活細胞的數量成正比。用酶聯免疫檢測儀在450nm波長處測定其光吸收值，可間接反映活細胞數量。該方法已被廣泛用于一些生物活性因子的活性檢測、大規模的抗腫瘤藥物篩選、細胞增殖試驗、細胞毒性試驗以及藥敏試驗等。

測試中，對樣品設置6-8個濃度梯度，利用DRG細胞進行30種中藥提取物樣品的細胞毒性測試， 根據酶標儀原始讀數計算樣品特定濃度下的細胞活力，從而計算出樣品對細胞的半致死濃度（CC50），評價藥物對細胞的毒性作用。經過該項測試，選取細胞活力為80%的樣品濃度作為后續實驗的測試最高濃度開展項目實驗。

膜片鉗：

膜片鉗又稱單通道電流記錄技術，用特制的玻璃微吸管吸附于細胞表面，可測量單個離子通道開放產生的pA量級的電流，這種通道開放是一種隨機過程。通過觀測單個通道開放和關閉的電流變化，可直接得到各種離子通道開放的電流幅值分布、開放幾率、開放壽命分布等功能參量，并分析它們與膜電位、離子濃度等之間的關系，廣泛用于藥物對離子通道受體抑制作用的測試。

測試中，在室溫下用全細胞膜片鉗技術記錄相應激動劑誘發的通道電流。玻璃微電極由玻璃電極毛胚（BF150-86-10，Sutter）經拉制儀（P97，Sutter）拉制而成，灌注電極內液后的尖端電阻為2-5 MΩ左右，將玻璃微電極插入放大器探頭即可連接至膜片鉗放大器。鉗制電壓和數據記錄由pClamp軟件通過電腦控制和記錄，采樣頻率為10 kHz，濾波頻率為2 kHz。在得到全細胞記錄后，細胞鉗制在0 mV，300 ms斜坡電壓從-100 mV至+100 mV，每2 s施加此電壓刺激并給予激動劑誘發通道電流，電流誘發40 s以上并確定無衰減后開始給藥過程。每個測試濃度至少給予20 s。數據分析處理采用pClamp，GraphPad Prism 5和Excel軟件。不同化合物濃度對TRPV1通道電流（+100 mV時誘發的電流幅度）的抑制程度用以下公式計算：

Inhibition % = [1 –（I / Io）] × 100%

其中，Inhibition % 代表化合物對電流的抑制百分率，I和Io分別表示在加藥后和加藥前電流的幅度，評價中藥提取物樣品對該通道的抑制作用。

鈣成像：

用熒光探針標記樣本中的鈣離子,根據樣本中的熒光探針特性單色光源發出單色光,誘發出熒光。然后根據傳感器檢測到的熒光特性即可分析樣本中的鈣離子濃度。探針與鈣結合后不僅產生熒光強度的變化，從而檢測細胞中鈣離子的濃度變化。

采用高內涵蔡司熒光顯微鏡儀器進行熒光信號記錄，20倍的物鏡，曝光100 ms和200 ms各記錄1次加激動劑刺激前的，然后開始加入5激動劑化合物，測試樣品熒光強度的變化。

客戶反饋

在測試過程中和客戶保持溝通，雖然在細胞復蘇、培育階段出了一點問題，但是客戶總體比較滿意。